-
Nanobiofotonika pro medicínu budoucnosti
Grantová agentura: GAČR
Identifikační číslo grantu: P205/12/G118
Hlavní řešitel: Prof. Ing. Jiří Homola, CSc., DSc. (Ústav fotoniky a elektroniky AV ČR, v. v. i.)
Spoluřešitelé:
Prof. RNDr. Josef Štěpánek, CSc.
Annotace grantu
Biofotonika představuje jednu z nejrychleji se rozvíjejících vědeckých disciplín současnosti. Očekává se, že biofotonika se bude významně podílet na formování nové generace nástrojů a metod pro medicinální výzkum a diagnostiku a přispěje tak k efektivnější, kvalitnější a dlouhodobě udržitelné zdravotní péči. Navrhovaný projekt je projektem základního orientovaného výzkumu v oblasti biofotoniky se zaměřením na biosenzory založené na fotonických nanostrukturách. Hlavní výzkumné oblasti tohoto projektu zahrnují jak výzkum fotonických jevů na kovových nanostrukturách s povrchovými plasmony a nových nástrojů pro jejich teoretickou analýzu, tak propojení těchto nanostruktur s biomolekulami a studium interakcí mezi biofotonickými nanostrukturami a biologickými vzorky. Projekt dále zahrnuje přípravu a experimentální charakterizaci speciálních nanostruktur pro nové typy biosenzorů na bázi resonance povrchových plasmonů (SPR) a povrchem zesíleného Ramanova rozptylu (SERS) pro detekci biomarkerů onkohematologických onemocnění.
-
Regulační úseky nukleových kyselin - polymorfismus, dynamika a interakce
Grantová agentura: GAČR
Identifikační číslo grantu: 15-06785S
Hlavní řešitel: Prof. RNDr. Josef Štěpánek, CSc.
Annotace grantu
Projekt je zaměřený na detailní studium strukturního uspořádání, tvorby biologicky relevantních komplexů a dynamiky vybraných
reprezentativních typů regulačních úseků nukleových kyselin - DNA guaninových kvadruplexů, sekvencí miRNA a DNA transkripčních
elementů obsahujících CArG box - pro objasnění molekulárního mechanismu jejich regulační funkce a jejího ovlivňování externími faktory,
jmenovitě molekulárním crowdingem, teplotou a molekulárním okolím zabezpečujícím nábojovou kompenzaci. Úseky nukleových kyselin,
případně jejich komplexy s klíčovými proteiny, budou studovány metodami SPR biosenzoru, Ramanovy a NMR spektroskopie, CD
spektroskopie, Ramanovy optické aktivity a molekulárně-dynamických simulací.
-
UV rezonanční Ramanův rozptyl nukleových kyselin
Grantová agentura: GAUK
Identifikační číslo grantu: 691412
Hlavní řešitel: RNDr. Jakub Klener, Ph.D.
Spoluřešitelé:
Prof. RNDr. Josef Štěpánek, CSc.
Annotace grantu
Projekt je zaměřen na problematiku určování sekundárního a terciálního
strukturního uspořádání nukleových kyselin (NA) a jejich interakcí. S
ohledem na požadavek měřit v přirozeném vodném prostředí, je pro tento
účel velmi vhodná Ramanova spektroskopie, umožňující získávání
základních informací o struktuře, strukturních změnách NA a jejich
komplexaci s dalšími molekulami. Nevýhodou standardní Ramanovy
spektroskopie používající excitační záření z viditelné oblasti spektra
je nutnost poměrně vysoké koncentrace NA a problémy s častou kontaminací
vzorků cizorodými nízkomolekulárními látkami. Tyto problémy principiálně
překonává rezonanční Ramanův rozptyl (RRS), který používá excitační
záření v oblasti dlouhovlnného absorpčního pásu nukleových kyselin. S
ohledem na podstatně vyšší náročnost na technické zařízení, justaci
spektrometru i použití postupů zamezujících vzniku artefaktů způsobených
fotopoškozením NA, je však tato technika používána pro studium NA zatím
poměrně vzácně.
Náplní projektu bude vedle stavby UV rezonančního Ramanova spektrometru
a vývoje vhodné techniky pro práci s UV fotocitlivým vzorkem především
systematické proměření sad modelových struktur nukleových kyselin a
porovnání se standardními vibračními a elektronovými spektry těchto
látek, aby bylo možné nalézt a interpretovat konformační a interakční
RRS markery. Tyto poznatky budou aplikované při navazujícím studiu
vybraných strukturních motivů nukleových kyselin, které se významně
uplatňují při přenosu a expresi genetické informace.
-
Molekulární mechanismy rozpoznání DNA regulačního segmentu transkripčními faktory z rodiny MADS-box
Grantová agentura: GAUK
Identifikační číslo grantu: 402111
Hlavní řešitel: Mgr. Barbora Řezáčová
Spoluřešitelé:
Prof. RNDr. Josef Štěpánek, CSc.,
Mgr. Pavla Ottová,
RNDr. Václav Profant
Annotace grantu
Projekt je zaměřen na studium fyzikálně-chemických vlastností a tvorby
komplexů transkripčních faktorů rodiny MADS-box a regulačního segmentu
DNA. Cílem projektu je objasnění funkční role MADS-boxu při specifickém
rozpoznávání DNA segmentu obsahujícího CArG-box (CC (A/T)6GG).
Geometrie spolu s dynamikou modelových oligomerů, proteinu a jejich
komplexu budou charakterizovány pomocí spektroskopických metod,
především Ramanovy a UV absorpční spektroskopie, stacionární i časově
rozlišené fluorescenční spektroskopie včetně metod stopped flow a
dohasínání anizotropie fluorescence. K doplnění termodynamických
charakteristik budou využita mikrokalorimetrická měření (DSC).
V prvním roce řešení bude zjištěn vliv vnějších podmínek, zejména pH,
teploty a přítomnosti vybraných kationtů na stabilitu konformace
modelových oligonukleotidů, proteinů a komplexů protein-oligonukleotid a
charakterizovány projevy vzniku komplexu MADS-boxu s cílovým DNA
segmentem na jeho spektrum Ramanova rozptylu, fluorescenční emisní
spektrum a jeho anizotropii.
Další etapy řešení projektu budou věnované studiu dynamiky DNA segmentu,
modelových proteinů a jejich komplexů pomocí dohasínání anizotropie
fluorescence vnitřního fluoroforu (Tyr) i fluorescenčních značek a/nebo
sond.
-
Vznik a dynamika strukturních motivů nukleových kyselin podílejících se na regulaci genové exprese
Grantová agentura: GAČR
Identifikační číslo grantu: 202/09/0193
Hlavní řešitel: Prof. RNDr. Josef Štěpánek, CSc.
Spoluřešitelé:
Ing. Ivan Rosenberg, CSc. (Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i.),
Prof. Ing. Jiří Homola, CSc., DSc. (Ústav fotoniky a elektroniky AV ČR, v. v. i.),
Michaela Vorlíčková (Biofyzikální ústav, Akademie věd České republiky, v.v.i.)
Annotace grantu
Projekt se zabývá vlastnostmi důležitých úseků nukleových kyselin (NA) z
hlediska jejich strukturních fluktuací a kinetiky tvorby a zániku
strukturních útvarů, případně jejich komplexů. Hlavní důraz bude kladen
na použití široké škály pokročilých experimentálních technik včetně
mikro-Ramanovy spektroskopie, senzorů na bázi rezonance povrchových
plasmonů (SPR) a dynamických NMR měření na 13C-značených nukleotidech,
doplněných molekulárně-dynamickými simulacemi. Výzkum bude zaměřen na
několik skupin NA strukturních motivů významných pro přirozenou či uměle
řízenou regulaci genové exprese. Kromě důkladného porozumění strukturním
a dynamickým vlastnostem přirozených i chemicky modifikovaných NA
strukturních motivů dojde i k rozvoji určitých experimentálních technik,
konkrétně k vývoji směšovacího mikrofluidního systému pro mikro-Ramanova
měření a k implementaci nové koncepce SPR snímání s polarizačním
kontrastem pro vysoce paralelizovaná měření.
-
TAR a DIS segmenty HIV-1 RNA: strukturní stabilita vlásenek a jejich komplexů s potenciálními aptamery
Grantová agentura: GAUK
Identifikační číslo grantu: 50910
Hlavní řešitel: Mgr. Pavla Ottová
Spoluřešitelé:
Prof. RNDr. Josef Štěpánek, CSc.,
Mgr. Barbora Řezáčová
Annotace grantu
Tento projekt je zaměřen na experimentální studium strukturní stability
význačných vlásenek HIV–1. Pomocí analýzy teplotních závislostí spekter
Ramanova rozptylu a výsledků doplňkových měření UV absorpce a
mikrokalorimetrických měření bude popsán stabilizující vliv hořečnatých
iontů na strukturu a flexibilitu vlásenky TAR, její aptamer R06 a jejich
„kissing“ komplex. Tím budou vyjasněny fyzikálně-chemické podmínky pro
úspěšnou inhibici regulační funkce TAR vlásenky pomocí aptamerové
strategie. Dalším úkolem projektu, který bude řešen v následujících
letech, je charakterizace teplotní závislosti struktury DIS vlásenky a
jejích potencionálních aptamerů a srovnání tvorby a stability „kissing“
komplexů mezi dvojicí DIS vlásenek a mezi DIS vlásenkou a jejím
aptamerem. Rovněž bude v rámci projektu objasněná i úloha hořečnatých
iontů při stabilizaci struktury vlásenky DIS a jejích komplexů.
-
Strukturní a fyzikální vlastnosti komplexů RNA vlásenek s chemicky modifikovanými aptamery
Grantová agentura: GAUK
Identifikační číslo grantu: 147507
Hlavní řešitel: Mgr. Jan Vachoušek
Spoluřešitelé:
Prof. RNDr. Josef Štěpánek, CSc.,
Mgr. Pavla Ottová,
Mgr. Barbora Řezáčová
Annotace grantu
Studium vlastností RNA vlásenek má velký význam zvláště pro antivirové
terapie, neboť RNA vlásenky plní důležité funkce v replikačním cyklu
především retrovirů, včetně viru HIV. Mezi nejvíce studované RNA
vlásenky v současnosti patří vlásenky TAR a DIS vyskytující se v HIV
virové RNA. Funkci těchto RNA vlásenek lze úspěšně blokovat pomocí
chemicky modifikovaných antisense aptamerů, které ukazují, že mají
potenciál otevřít další cestu vedoucí k potlačení epidemie HIV v
budoucnosti. Pro úspěšný návrh účinných antisense aptamerů je však
nezbytné znát strukturu a vlastnosti nejenom jich samotných, ale také
jejich RNA cílových protějšků. Tento problém bude řešen pomocí Ramanovy
spektroskopie, UV spektroskopie a dalších doplňkových metod.
-
Spektroskopická a molekulárně–dynamická charakterizace mechanismu interakce Ribonukleázy H s hybridním DNA/RNA duplexem.
Grantová agentura: GAUK
Identifikační číslo grantu: 257688
Hlavní řešitel: RNDr. Martin Kříž, Ph.D.
Spoluřešitelé:
Prof. RNDr. Josef Štěpánek, CSc.,
Mgr. Pavla Ottová,
Mgr. Barbora Řezáčová
Annotace grantu
Projekt je zaměřen na studium fyzikálně-chemických vlastností komplexů
proteinů a nukleových kyselin. Ke studiu těchto komplexů budou použity
spektroskopické metody, zejména Ramanova spektroskopie a
mikrospektroskopie, a dále molekulárně-dynamické simulace. Jako modelový
protein byl vybrán enzym Ribonukleáza H, který specificky interaguje s
hybridním duplexem DNA/RNA a selektivně degraduje RNA vlákno. Cílem
projektu je ujasnění vlivu chemické struktury páteře neštěpeného řetězce
(přirozená DNA versus modifikace) a bázových sekvencí, případně i role
vícevalentních iontů při vazbě enzymu na substrát a v průběhu štěpení
RNA řetězce.
-
Izopolární fosfonátové oligonukleotidy jako alternativa fosforothioátových při regulaci exprese genomu
Grantová agentura: GAČR
Identifikační číslo grantu: 203/05/0827
Hlavní řešitel: Ing. Ivan Rosenberg, CSc. (Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i.)
Spoluřešitelé:
Prof. RNDr. Josef Štěpánek, CSc.
Annotace grantu
Projekt je zaměřen do oblasti základního výzkumu přípravy a vlastností
nového typu chimerických fosfonátových analogů oligonukleotidů
obsahujících izopolární fosfonátovou internukleotidovou vazbu. Tyto
oligonukleotidy se studují v relevantních biochemických a biologických
experimentech abychom zjistili, zda-li také tyto látky mají svá slabá
místa a omezení podobná těm, které se vyskytují u fosforothioátových
oligonukleotidů. Vyjímečná rezistence našich oligonukleotidů s
fosfonátovými internukleotidovými vazbami (např. 3’-O-P-C-O-5’’,
3’-O-C-P-O-5’’ a 3’-O-P-C (OH)–5’’) proti štěpení nukleázami,
protektivní účinek modifikovaných vazeb na sousední vazby
fosfodiesterové při působení nukleáz, vynikající hybridizační
vlastnosti, jakož i strukturní rozmanitost našich modifikací dávají
předpoklady pro přípravu chimerických oligonukleotidů jejichž vlastnosti
by byly přinejmenším srovnatelné s konstrukty složenými z
fosforothioátů. Očekáváme zásadní poznatky, které by mohly být přímo
využity při optimalizaci oligonukleotidových konstruktů v antisensní,
antigenové a aptamerní strategii cílené na nové terapeutické přístupy
založené na regulaci exprese genomu.
-
Neinvazivní fyzikální diagnostika molekulárních interakcí při regulaci genové exprese
Grantová agentura: GAČR
Identifikační číslo grantu: 202/05/0628
Hlavní řešitel: Prof. RNDr. Josef Štěpánek, CSc.
Annotace grantu
Rozvoj účinných optických metod citlivého sledování biomolekulárních
interakcí v malých objemech vzorků bez nutnosti zavádění molekulárních
značek do interakčního místa a jejich aplikace při studiu těch interakcí
nukleová kyselina – protein, které hrají významnou roli v regulaci
genové exprese a v “antisense” terapii. U vybraných štěpících a
regulačních enzymů bude sledování tvorby, struktury a biochemické
aktivity jejich komplexů s nukleovými kyselinami. Metodický vývoj
zahrnuje
</p>
<ul>
<li>
technické a matematické řešení přesných měření Ramanova rozptylu v nmol
množstvích,
</li>
<li>
konstrukci senzorového systému vysokého rozlišení s až osmi v reálném
čase měřícími kanály, založeném na rezonanci povrchových plasmonů,
</li>
<li>
vypracování komplexních interakčních modelů pro biomolekuly zahrnujících
i vliv hydrodynamických podmínek,
</li>
<li>
přípravu modifikovaných oligonukleotidů s různou strukturou cukr –
fosfátové páteře.
</li>
</ul>