Integrovaný Ramanův systém HR 800

HR800 je integrovaný Ramanův systém, který používá uspořádání pro měření zpětného rozptylu. Mikroskop je konfokálně spojen se spektrografem s ohniskovou vzdáleností 800 mm a dvěma vyměnitelnými difrakčními mřížkami.


Obr. 1. Schéma integrovaného Ramanova systému HR 800.

Optická dráha svazku


Obr. 2. První část optické dráhy svazku.

Na obrázku 2 je znázorněna optická dráha svazku první částí systému. Laserový svazek vycházející z laseru vstupuje do systému pomocí dvou zrcadel M1 a M2, poté prochází první irisovou clonou I1 před interferenčním filtrem a druhou I2 před čočkou L2. Interferenční filtr se používá k odstranění vedlejších plazmových linií laseru. Pro každou excitační spektrální čáru je nezbytný zvláštní interferenční filtr. Pokud se používá vnější laserový zdroj, svazek je vpouštěn pomocí odstranitelného zrcátka na zasunovací zrcadlo M5, které je při použití standardního He–Ne laseru posunuto mimo optickou dráhu svazku. Laserový svazek je zaostřen pomocí čočky L1 na štěrbinu H1, která tvoří prostorový filtr a určuje aperturu svazku před vstupem do mikroskopu. Tato štěrbina je také používána jako reference při ladění přístroje. Před čočkou L1 jsou umístěny šedé filtry, které jsou ovládány softwarem. Jsou nastavitelné do 9 různých poloh: 3 prázdná místa a 6 neutrálních filtrů o optické hustotě 0.3, 0.6, 1, 2, 3 a 4.


Obr. 3. Druhá část optické dráhy svazku s Notch filtrem.

Po průchodu prostorovým filtrem H1 je laserový svazek odražen systémem zvaným LIRS (laser injection rejection system), který se skládá ze zrcátka M8 a Notch filtru (viz obrázek 3). Tento systém umožňuje změnit úhel, pod kterým laserový svazek dopadá na Notch filtr. Při správném nastavení je svazek úplně odražen směrem ke vzorku. Čočka L3 vytváří rovnoběžný svazek, který je objektivem mikroskopu zaostřen na vzorek. Odražené záření a záření vzniklé Ramanovým a Rayleighovým rozptylem je sbíráno objektivem a postupuje stejnou cestou zpět. Záření, které má stejnou vlnovou délku jako excitační čára laseru, je Notch filtrem odraženo ve směru zrcátka M8. Záření, jehož vlnová délka byla Ramanovým rozptylem posunuta a leží mimo oblasti úplného odrazu Notch filtru, filtrem naopak projde.
V optické cestě svazku vystupujícího z mikroskopu mohou být umístěny dva děliče svazku 50/50 pro sledování vzorku TV kamerou. První dělič vede světlo bílé lampy z optického vlákna a posílá ho na vzorek, druhý posílá přes čočku L5 obraz vzorku do TV kamery.
Autofokusační systém je součástí piezoelektrické jednotky, která slouží k jemným posunům vzorku vůči ohniskové rovině mikroskopu. Umožňuje systematické měření v několika předem zvolených bodech a softwarově nastavitelné zaostření do různých hloubek vzorku. K určení vzdálenosti vzorku a ostření objektivu je použita fotodioda.


Obr. 4: Třetí část optické dráhy svazku zakončená spektroskopem.

Svazek skládající se už jen z Ramanovsky rozptýleného světla (jeho složkou může být ale i fluorescence) prochází čočkou L3 a vytvoří obraz Ramanova svazku na konfokální štěrbině (viz obrázek 4). Před konfokální štěrbinou je oblast, do které se dají umístit polarizační filtry nebo druhý Notch filtr. Zvětšení obrazu, ke kterému dojde mezi vzorkem a konfokální štěrbinou, je dáno zvětšením zdvojeného objektivu mikroskopu vynásobeného faktorem 1,4. Tento faktor je dám tím, že délka tubusu mikroskopu Olympus (180 mm) je jiná než ohnisková vzdálenost čočky L3 (250 mm). Zvětšení je tedy 250/180 = 1,4.
Čočky L7 a L8 zobrazují konfokální štěrbinu na nastavitelnou vstupní štěrbinu spektrografu S1 a upravují aperturu svazku na aperturu spektrometru. Obraz konfokální štěrbiny je na štěrbinu S1 zobrazen v pětinásobném zmenšení. Přímo za štěrbinou S1 je umístěna závěrka spektrometru. Svazek je mezi čočkami L7 a L8 rovnoběžný, čočka L8 tedy vyváří obraz štěrbiny na spektrografu.

Součásti integrovaného systému HR 800

  • Laser
    Standardní laser je Helium–Neonový laser (He–Ne) s výkonem 20 mW, vlnovou délkou 632,817 nm. Laser je umístěn v zadní části přístroje, který obecně umožňuje napojení libovolného laseru s excitační vlnovou délkou v rozmezí 440–800 nm.

  • Notch filtr
    Při použití jediného spektrografu je nutné do optické dráhy začlenit holografický Notch filtr. Notch filtr je holografická mřížka, která je specifická pro jednu vlnovou délku, kterou pod daným úhlem úplně odráží. Záření jiných vlnových délek filtr naopak propouští.

  • Spektrograf
    Spektrograf HR 800 je spektrograf s asymetrickou montáží Czerny–Turner, který dává rovnoměrné rozložení intenzity na výstupu. Ohnisková vzdálenost spektrografu je 800 mm. Obsahuje dvě měnitelné mřížky, standardní s 1800 vrypy/mm a druhou s 600 vrypy/mm. Spektrograf také obsahuje laserovou diodu pro naladění přístroje. Při použití mřížky s 1800 vrypy/mm může být světlo z diody přesměrováno proti směru laserového svazku a pomocí něho může být nastavena konfokální štěrbina. Rozlišení spektrografu závisí na disperzi, šířce vstupní štěrbiny a na velikosti jejího zobrazení na CCD. Velikost obrazu vstupní štěrbiny di na CCD je dána vztahem:

    di= ds· cosθ /cos ν

    kde θ je úhel, pod kterým světlo dopadá na mřížku a ν je difrakční úhel na mřížce. Rozlišení tedy závisí na apertuře štěrbiny a vlnové délce světla. CCD detektor je chlazený kapalným dusíkem a obsahuje 1024×256 pixelů.

  • Konfokální štěrbina
    Konfokální štěrbina je nastavitelná v rozmezí 0–1000 μm. Nastavuje se v poměru 1,4× zvětšení objektivu.

  • Mikroskop
    V systému je zabudovaný mikroskop BX40 (firma Olympus). Zaostřování se posunuje po 1 μm. Dostupné objektivy jsou 10× NA 0.25, 50 × NA 0.7, 100× NA 0.9. Mezi příslušenství patří makroadaptér pro instalaci objektivu o ohniskové vzdálenosti 40 mm a nástavná hlavice pro optické vlákno, pokud je laser navázaný do vlákna. Mikroskop je vybaven barevnou kamerou pro pozorování vzorku a stolkem pohyblivým v rovině XY.
    U neprůhledných vzorků pochází Ramanův signál téměř výhradně z povrchu vzorku a jeho intenzita je tedy přímo úměrná nasbíranému toku. Proto je lepší používat objektiv s větší numerickou aperturou (NA = n·sinα, α je sběrný prostorový úhel, n je index lomu čočky), který sbírá světlo z většího prostorového úhlu – měřit v tzv. mikro–módu. Pro průhledné vzorky je situace přesně opačná. Je vhodné použít objektiv s velkou hloubkou ostrosti, aby bylo možné posbírat signál z většího objemu vzorku. Proto je vhodnější použít objektiv s malou aperturou – makro–objektiv. Pro měření v makro–módu na přístroji HR 800 je možné místo jednoho z okulárů nasadit nástavec s čočkou o ohniskové vzdálenosti 40 mm, která laserový svazek nasměruje do horizontálního směru. Pro tento účel se za vzorek umísťuje sférické zrcadlo, které svazek odrazí pro zpětný průchod vzorkem.