Ramanova mikroskopie buněk

Konfokální Ramanova mikroskopie, nebo také mikrospektroskopie, kombinuje Ramanovu spektroskopii s optickou konfokální mikroskopií. Excitační laserové záření je zaostřeno pomocí objektivu mikroskopu do malého místa vzorku, kdy nejmenší možná velikost tohoto excitovaného objemu je dána Rayleighovým kritériem. Rozptýlené záření je sbíráno tímtéž objektivem, pružně rozptýlené záření je odstraněno pomocí filtru, a o několik řádů slabší nepružně rozptýlené – ramanovské – záření prochází do spektrografu a dále dopadá na detektor.

Díky tomuto uspořádání lze získat Ramanova spektra, a tedy i informaci o chemickém složení a fyzikálně-chemických podmínkách v daném místě, s vysokým prostorovým rozlišením, typicky v řádu μm3 i méně. Toho lze využít, kromě jiného, pro studium biologických objektů – tkání, buněk i jednotlivých buněčných organel.

Oproti běžněji používané fluorescenční mikroskopii má Ramanova mikroskopie buněk několik výhod. Předně není třeba vzorek zpravidla nijak předem připravovat pro měření. Signál získáváme přímo z přirozeně přítomných biomolekul, na rozdíl od fluorescenční mikroskopie, kde typicky do buněk introdukujeme cizorodá fluorescenční barviva, při čemž existuje riziko, že tímto procesem ovlivníme i chování studovaných látek. Fluorescencí také zpravidla studujeme jednu nebo několik málo buněčných komponent, zatímco Ramanova mikroskopie podává informaci o všech najednou. Na druhou stranu je nepružný rozptyl obecně velmi slabý jev, což klade nároky na experimentální vybavení, a Ramanova mikroskopie zdaleka nedosahuje takové specificity, jako například imunofluorescenční značení nebo značení pomocí fluorescenčních proteinů. Porovnání s další metodou vibrační mikrospektroskopie, infračervenou mikroskopií, ukáže několik dalších výhod Ramanovy mikroskopie. Předně získáme lepší prostorové rozlišení díky kratší vlnové délce excitačního záření. Pro biologické vzorky je také zásadní pouze slabý signál vody ve spektrální oblasti charakteristických vibrací biomolekul.

Podle [1] byly poprvé Ramanovou mikrospektroskopií zkoumány jednotlivé buňky v roce 1990, kdy Gerwin J. Puppels s kolegy prováděli experimenty na lidských lymfocytech [2]. První měření na živých buňkách provedl Yu-San Huang se svými spolupracovníky v roce 2003 [3], a to na kvasinkových buňkách druhu Schizosaccharomyces pombe. Huang a kolegové měřili spektra z centrální části kvasinkové buňky v průběhu jejího buněčného cyklu. Buňky byly po měření schopny dokončit další dva buněčné cykly, a tedy celý proces měření beze všech pochybností přežily.

Ramanova mikroskopie nachází mimo jiné uplatnění v medicínském výzkumu a směřuje i do lékařské praxe. Ukazuje se, že Ramanova spektra jsou dobrým indikátorem stavu buněk – lze podle nich rozlišit například rakovinnou tkáň od zdravé, včetně jednotlivých stádií procesu vzniku rakoviny, a to často lépe a hlavně dříve, než dokáže klasická histopatologie [4]. Při takovém využití Ramanovy spektroskopie není primárním účelem naměřená Ramanova spektra interpretovat, slouží pouze jako jakýsi „čárový kód“ nebo „otisk prstu“. Ten je pomocí pokročilých počítačových a statistických metod porovnán s rozsáhlou knihovnou spekter a počítačový algoritmus poté určí stádium rakoviny.

Na podobném principu je založena i identifikace patogenních mikroorganismů způsobujících noskomiální – v nemocnici získané – infekce. Tato metoda je již komerčně dostupná (společnost RiverD).

V roce 2015 byla založena nezisková společnost ClirSpec (The International Society for Clinical Spectroscopy), jejímž cílem je podporovat přenos vibračně-spektroskopických technik do klinické praxe.

Na našem oddělení se věnujeme Ramanově mikroskopii kvasinek [5] a jednobuněčných řas [6].Zajímá nás vliv kultivačních podmínek na chemické složení jednotlivých buněčných organel, průběh buněčného cyklu a akumulace zásobních látek u řas – škrobů, lipidů a polyfosfátu. Mikroskopické řasy se již používají pro komerční produkci vzácných biolátek, například karotenů, ale například i při výrobě bioetanolu, a proto je studium zajímavé nejen z biologického, ale i z praktického hlediska.

Společným jmenovatelem řady experimentů je polyfosfát, „anorganický“ biopolymer složený z jednotek až stovek fosfátových jednotek. Řada biologických funkcí této makromolekuly ještě zdaleka není dobře prostudována. Polyfosfát slouží jako zásobní molekula pro fosfor, osmoticky výhodnější oproti volnému fosfátu. U některých mikroorganismů funguje jako zdroj energie, s volnou energií podobnou ATP. Polyfosfát může dále být zdrojem fosforu pro fosforylaci glukózy, AMP nebo NAD a slouží též jako chelatační činidlo pro kationty. Pomáhá tak udržovat zásobu biologicky významných kationtů a díky vazbě těžkých kovů detoxifikuje cytosol. Účastní se též membránového transportu [7]. Spekuluje se též o roli polyfosfátu při vzniku života na Zemi [8].

Literatura

  1. Kaliaperumal V, Hamaguchi HO. Casting new physicochemical light on the fundamental biological processes in single living cells by using Raman microspectroscopy. Chemical record. 2012;12 (6):567~~80. doi:10.1002/tcr.201200008.
  2. Puppels GJ, Demul FFM, Otto C, Greve J, Robertnicoud M, Arndtjovin DJ et al. STUDYING SINGLE LIVING CELLS AND CHROMOSOMES BY CONFOCAL RAMAN MICROSPECTROSCOPY. Nature. 1990;347 :301~~3. doi:10.1038/347301a0.
  3. Huang Y-S, Karashima T, Yamamoto M, Hamaguchi H-o. Molecular-level pursuit of yeast mitosis by time- and space-resolved Raman spectroscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 2003;34 (1):1~~3. doi:10.1002/jrs.960.
  4. Diem M, Miljković M, Bird B, Chernenko T, Schubert J, Marcsisin E et al. Applications of Infrared and Raman Microspectroscopy of Cells and Tissue in Medical Diagnostics: Present Status and Future Promises. Spectroscopy: An International Journal. 2012;27:463~~96. doi:10.1155/2012/848360.
  5. Bednárová L, Palacký J, Bauerová V, Hrušková-Heidingsfeldová O, Pichová I, Mojzeš P. Raman Microspectroscopy of the Yeast Vacuoles. Spectroscopy: An International Journal. 2012;27:503~~7. doi:10.1155/2012/746597.
  6. Moudříková Š, Mojzeš P, Zachleder V, Pfaff C, Behrendt D, Nedbal L. Raman and fluorescence microscopy sensing energy-transducing and energy-storing structures inmicroalgae. Algal Research. 2016;16:224~~32. doi:10.1016/j.algal.2016.03.016.
  7. Kulaev IS, Vagabov VM, Kulakovskaya TV. The biochemistry of inorganic polyphosphates. Chichester: JohnWiley & Sons, Ltd; 2004.
  8. Kornberg A, Rao NN, Ault-Riché D. Inorganic poylphosphate: a molecule of many functions. Annual review of biochemistry. 1999;68:89–125.

Více informací

Na našem oddělení se problematikou zabývají Peter Mojzeš a Šárka Moudříková