Mikrofluorescenční techniky pro monitorování vstupu do buněk a vnitrobuněčné distribuce potenciálních chemoterapeutik

Fluorescenční mikroskopické metody umožňují vizuální sledování průniku oligonukleotidů do buněk a následně také jejich distribuci uvnitř buňky. Fluorescenční značka dobře “přišitá” k oligonukleotidu představuje vynikající detekční prvek, s pomoci kterého můžeme hlouběji poznat chování modifikovaných oligonukleotidů ve vnitrobuněčném prostředí. K těmto technikám patří konfokální fluorescenční mikroskopie a metody časově rozlišené konfokální mikrospektrofluorimetrie, dále pak fluorescenční korelační spektroskopie a metoda laserové fotolýzy.

Fluorescenční mikroskopické zobrazování

Fluorescenční zobrazování nám dává jednoznačný důkaz (nebo vyloučení) přítomnosti “antisenzního” oligonukleotidu v buňce. Metoda umožňuje monitorovat postup oligonukleotidu – proniknutí lipidovou buněčnou membránou a následně distribuci v cytoplazmě a jádře. Při realizaci experimentu je podstatné, aby nedošlo k odštěpení fluorescenční značky od molekuly oligonukleotidu. V každém případě musí být potenciální možnost oddělení testována a to pomocí časově rozlišené mikrospektrofluorimetrie.

Doposud studované oligonukleotidy sestávaly z 15ti bazí, všechny bázy buďto thyminové nebo adeninové. Vzhledem k tomu, že buněčné enzymy by přirozený oligonukleotid v relativně krátkém čase rozstříhaly na menší části, je nutné, aby byl chemicky modifikován pro ochranu před jejich působení. Možnosti modifikace jsou různé, nejvíce jsou studovány fosforothioáty, kde je jeden nevazebný kyslík ve fosfátovém řetězci nahrazen sírou. Vývojem nových modifikací oligonukleotidu se zabývá i skupina Ing. Rosenberga z Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR, se kterou naše oddělení spolupracuje.

Modifikované oligonukleotidy, se kterými pracujeme, jsou značeny fluorescenční značkou (markerem), většinou rhodaminem. V literatuře se uvádí také používání fluoresceinu. Každá ze značek má své přednosti i nevýhody. Fluorescein se na rozdíl od rhodaminu podstatně více fotodegraduje. Rhodamin je stabilnější a jeho charakteristiky jsou nezávislé na pH prostředí, ve kterém se nachází. Vzhledem k různým hodnotám pH uvnitř buňky (cytosol, buněčné jádro a další organely) je tato jeho vlastnost pro nás žádaná. Na trhu se v současnosti uplatňuje nová skupina fluorescenčních značek – Alexa Fluor Dyes, produkt firmy Molecular Probes. Jedná se o látky, ve kterých se pojí všechny dobré vlastnosti rhodaminu a fluoresceinu a jejich širší paleta umožňuje excitaci v celé oblasti viditelného spektra.

Pro studium průniku oligonukleotidů do buněk používáme savčí buněčné linie, a to především 3T3 linii - myší fibroblasty. Je to adhesivní buněčná linie rostoucí na povrchu Petriho misky, což je případ zvláště vhodný pro mikroskopické pozorování. Pro pozorování buněk volně plovoucích v médiu (neadhezivní buněčné linie) je nutné je “připevnit” na povrch podložky pomocí fixační procedury.

Fluorescenční zobrazování spolehlivě ukáže charakter “obarvení” buněčného prostředí značeným modifikovaným oligonukleotidem. Stejnoměrné (homogenní) “obarvení” cytoplazmy nebo jádra svědčí o difúzním průniku studované látky dovnitř buňky, což představuje ideální případ, protože je tak umožněn přímý přístup oligonukleotidů ke strukturám, které má blokovat. V opačném případě značené oligonukleotidy vytvářejí shluky a ty je možné pozorovat v mikroskopu jako jasné tečky. Shluky zůstávají buď na povrchu buněčné membrány, anebo se dostávají dovnitř buňky procesem endocytózy, kde zůstávají uzavřené ve váčcích vznikajících vychlípením membrány a následným odtržením. Pro většinu typů buněk a modifikací oligonukleotidů je nutno k dosažení homogenní distribuce a vyhnutí se endocytóze použít podpůrného prostředku. V našich experimentech jsme v tomto směru obrátili pozornost k porfyrinům, resp. jejich katonickým derivátům, které se ukázaly jako účinné pro podporu dopravy oligonukleotidů do buněk.

Časově rozlišená mikrospektrofluorimetrie

Doba dohasínání fluorescence je jedinečnou charakteristikou studovaného fluorescenčně značeného oligonukleotidu. Má exponenciální charakter s časovou konstantou ležící zpravidla v intervalu od jednotek až po stovky ns a je velice citlivá vůči různým chemickým a fyzikálním vlivům. Uvnitř buňky, kdy je studovaná molekula vystavena různorodým vlivům, je doba dohasínání fluorescence zpravidla složena z více exponenciálních složek s různými dobami dohasínání. Určení celkové doby dohasínání a zjištění zastoupených složek je hlavní úlohou metod časově rozlišené fluorimetrie.

Základním principem frekvenční modulační metody pro měření doby dohasínání je excitace studovaného vzorku sinusově modulovaným světelným zdrojem s nenulovou střední hodnotou intenzity. Zdroj je charakterizován hloubkou modulace intenzity, danou poměrem sinusové amplitudy ku střední hodnotě intenzity zdroje a frekvencí (zpravidla v oblasti od 1 do 250 MHz). Průběh intenzity detegovaného fluorescenčního signálu je vzhledem k excitačnímu světelnému zdroji fázově posunut o úhel úměrný době dohasínání, avšak původní excitační frekvence zůstává zachována. Zároveň dochází u fluorescenčního signálu k poklesu hodnoty hloubky modulace vzhledem k excitačnímu zdroji v míře rovněž úměrné této době. Pokud je přítomna jediná časová složka, pak lze její dobu dohasínání snadno vypočítat z hodnot demodulace i fázového posuvu podle jednoduchých vztahů.

Metoda časově rozlišeného měření dohasínání fluorescence ve frekvenční oblasti může být využita ve spojení s konfokálním fluorescenčním mikroskopem a spektrografem. Aparatura tohoto typu byla vybudována za účasti našeho pracoviště na Univerzitě Paris IV. Fluorescenční záření je v takovém případě sbíráno pomocí konfokálního mikroskopu z přesně určeného místa ve vzorku (nacházejícího se např. uvnitř buňky) a následně prochází spektrografem na jehož výstupu je možné pomocí mnohokanálového detektoru a modulační elektroniky získat časově rozlišené fluorescenční spektrum. Získáváme spektrum intenzity fluorescence a současně informaci o spektrálním rozložení fázového posuvu a demodulace. Abychom mohli přesněji získat informaci o dobách dohasínání fluorescence uvnitř nuňky a kvantifikovat míru zastoupení v různých oblastech spektra, je nutné provést měření fluorescenčních spekter pro řadu po sobě jdoucích frekvencí a pomocí fitovacích metod (tzv. globální analýzou) tyto veličiny pak lze vypočíst.

Na základě určení dob dohasínání jednotlivých složek zastoupených v komplexním spektru získaném z nitra buňky (jádra i cytoplazmy) a příslušných spektrálních posuvů emisních maxim je možné předpokládat na jakou substrukturu se studovaný oligonukleotid v buňce váže. Spolu s referenčními údaji je pak možno usuzovat k jakým interakcím této molekuly v buňce dochází.