Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS) biomolekul.

Povrchem zesíleným Ramanovým rozptylem (Surface–Enhanced Raman Scattering –SERS) se rozumí výrazné zesílení Ramanova rozptylu (typicky 10 4–106) pro molekuly adsorbované na vhodné kovové (nejčastěji stříbrné nebo zlaté) nanosubstráty (elektrody, ostrůvkové filmy, koloidy aj.). K celkovému zesílení přispívají dva mechanismy: elektromagnetický, který výrazně zesiluje intenzitu dopadajícího i rozptýleného záření díky resonanční excitaci povrchových plasmonů v kovu a chemický (nebo také molekulární), který zvyšuje polarizovatelnost molekuly v důsledku její silné interakce s kovovým povrchem. Elektromagnetický mechanismus vyžaduje přítomnost nanostruktur v kovovém povrchu a jeho příspěvek k celkovému zesílení je vždy o několik řádů vyšší než příspěvek mechanismu chemického. Podrobnější vysvětlení SERS teorie lze najít např. v přehledném článku [M. Moskovits, Rev. Mod. Phys. 57 (1985) 783].

SERS vzbudil při svém objevení [M. Fleischmann et al. Chem. Phys. Lett. 26 (1974) 163] ve 2. polovině 70. let značnou pozornost, která dodnes neopadla. Největší výhodou této metody je, že díky extrémnímu povrchovému zesílení lze pracovat za koncentrací, které otevírají řadu analytických aplikací dříve pro Ramanovu spektroskopii nedostupných. Ve speciálních případech, díky selektivní excitaci SERS-aktivních stavů poskytujících nejvýraznější SERS zesílení (tzv. “hot spots”), je dnes možné měřit SERS spektra z řádově jednotek molekul [např. K. Kneipp et al. Chem. Rev. 99 (1999) 2957]. Další nezanedbatelnou výhodu SERSu pro studium biomolekul je i to, že efektem povrchu je účinně zhášena fluorescence, která u silně fluoreskujících látek často zcela překrývá signál Ramanova rozptylu. V případě SERS studia je ale třeba mít stále na paměti, že specifická interakce zkoumané látky s kovovým povrchem může do značné míry ovlivnit relevantnost strukturní informace vyvozované ze SERS spekter, a proto se klasifikace možných strukturních změn vyvolaných adsorpcí studovaných molekul na kovový povrch stává klíčovým bodem jejich interpretace. I přes extrémní citlivost naráží možné analytické aplikace SERSu na problémy se špatnou reprodukovatelností získaných dat, které vyplývají z nehomogenity a nestability používaných SERS-aktivních povrchů.

Nejčastěji používanými SERS–aktivními povrchy jsou kovové (stříbrné nebo zlaté) koloidy, především díky levné a snadné přípravě a relativně úzké distribuci velikosti částic. Připravují se nejčastěji chemickou redukcí dusičnanu stříbrného borohydridem nebo citrátem sodným. Nevýhodou chemických koloidů je nestabilita jejich povrchových vlastností (typ a koncentrace reziduálních iontů, povrchový potenciál atp.), která vede k velké nestabilitě systémů a nereprodukovatelnosti získaných výsledků. Proto se z toho hlediska jeví jako velmi perspektivní nová metoda přípravy “chemicky čistých” koloidů laserovou ablací kovového plíšku ponořeného do vody pomocí pulsního Nd-YAG laseru [A. Fojtik, A. Henglein Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 97 (1993) 252]. V rámci hledání vhodnějších SERS-aktivních povrchů pro studium biomolekul jsme se i my zabývali přípravou stříbrných a zlatých kovových nanočástic laserovou ablací. Systematickým studiem experimentálních podmínek (výkon laseru, fokusace laserového svazku, ablační čas, míchání roztoku během ablace) se nám podařilo optimalizovat tuto přípravu a ukázat, že sekundární fragmentace velkých částic umožňuje získat koloidy s užší distribucí velikostí částic [Procházka et al. Anal. Chem., 69 (1997) 5103]. V posledních letech je značná pozornost věnována také kovovým nanočásticím imobilizovaným na pevných substrátech, které spojují výhody kovových koloidů (úzká a dobře definovaná distribuce velikosti částic) a pevných povrchů (stabilita a reprodukovatelnost samotných povrchů a následně SERS spekter z nich získaných). Účinné imobilizace zlatých nanočástic lze dosáhnout například použitím vhodného organosilanu, který na skleněných podložkách vytváří samouspořádanou vrstvu a přes funkční skupiny na konci řetězců na sebe váže zlaté nanočástice [R. G. Freeman et al. Science 267 (1995) 1629].

V naší laboratoři využíváme SERS spektroskopii ke studiu především porfyrinů. Pomocí stříbrných koloidů jsme získali spektra různých porfyrinů v koncentračním rozsahu 1&\#181;M–1nM. V případě porfyrinů ve formě volné báze je po adsorpci na stříbrný povrch pozorována metalace porfyrinů atomem stříbra ze stříbrného povrchu. Byla vyvinuta metoda analýzy časového vývoje SERS spekter a pomocí ní studována kinetika metalace porfyrinových derivátů v různých koloidních systémech. Bylo prokázáno, že z těchto kinetik je možné získat jinak těžko dostupné informace o chemickém stavu povrchu koloidu i o tendenci porfyrinových molekul k tvorbě agregátů. Sledování metalačních kinetik porfyrinů bylo pak úspěšně aplikováno ke studiu interakce porfyrinů s nukleovými kyselinami za velmi nízkých koncentrací. Aktuálně se zabýváme především přípravou SERS-aktivních povrchů na bázi stříbrných a zlatých koloidních nanočástic immobilizovaných na skleněné podložky.

Silanizace
\ Obr.1. Příprava SERS–aktivních povrchů

Aplikace těchto povrchů ke studiu porfyrinů ve formě volné báze ukázala, že v případě zlatých i stříbrných povrchů, je možné získat spektra porfyrinů v jejich nativní neporušené (nemetalované) formě. Dále se tyto povrchy dají úspěšně využít ke studiu ve vodě nerozpustných molekul, aniž bych odcházelo ke vlivu rozpouštědla. Ve spolupráci s Oddělením polymerních materiálů, Ústav makromolekulární chemie AV ČR (Dr. Jiří Pfleger) jsou tyto povrchy využívány ke studiu povrchem zesílených fotofyzikálních procesů organických molekul (ftalocyaniny, molekuly obsahující “azo” skupinu) v polymerních nanokompositech. Další spoluprací s tímto pracovištěm a skupinou Doc. Blanky Vlčkové (Katedra fyzikální chemie, PřF UK) je problematika týkající se SERS spektroskopie řešená v rámci projektu GAČR “Chemické procesy podporované účinky laserového záření v systémech s plasmonickými kovovými nanočásticemi”.


\